Автор:
Войтова Ксения Васильевна (научный сотрудник)
Организация:
Государственное научное учреждение, Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, лаборатория биотехнологии-диагностический центр, п. Краснообск, Новосибирская область
Конкурсная работа:
В настоящее время в нашей стране развивается молочное животноводство, что сопровождается высокой концентрацией животных на ограниченных территориях, изменениями технологии их содержания и кормления. Это приводит к возникновению у них вторичных иммунодефицитов и различных болезней, в том числе и инфекционных.
В этиологии массовых бронхопневмоний значительная роль принадлежит вирусам, размножение которых в органах респираторного тракта способствует активизации условно-патогенной микрофлоры, в частности бактерий семейства Pasteurellaceae. Одним из них является вирус респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Вирус вызывает болезнь, характеризующуюся сильным кашлем, высокой температурой и поражением нижних отделов дыхательных путей животных. Возбудитель строго специфичен, поражает только органы респираторного тракта и очень чувствителен к воздействию факторов внешней среды, особенно к многократным замораживаниям и оттаиваниям, низким значениям рН. При +4ºС он сохраняет свою активность в течение недели, при -70ºС - до 2- мес. В связи с низкой чувствительностью, а зачастую и невозможности проведения вирусологических исследований с использованием культур клеток, перспективным является использование молекулярных методов, особенно ПЦР (полимеразная цепная реакция).
Целью данной работы было изучение влияния сроков хранения в жидком азоте проб вируссодержащего материала на пригодность их исследования в ПЦР.
В работе использовали фильтрующие насадки двух фирм (TPP и еще одного производителя), культуральные матрасы трех фирм (TPP и еще 2-х производителей), культуральные планшеты трех фирм (TPP и еще 2-х производителей), криопробирки фирмы TPP и еще 2-х производителей.
Пробы органов верхнего и нижнего респираторного тракта, поступившие из хозяйств, где регистрировались массовые респираторные болезни животных, перетирали в фарфоровых ступках с песком, гомогенизировали и готовили 10%-е суспензии на физиологическом растворе, после чего центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 15 мин. Полученные суспензии предварительно исследовали в ОТ-ПЦР. В случае получения положительных результатов, вируссодержащую суспензию пропускали через фильтрующие насадки, затем вносили в перевиваемую культуру клеток ТЭБ (тестикулы эмбриона крупного рогатого скота). После пяти пассажей вируссодержащую суспензию титровали в 96-луночных плоскодонных планшетах, затем делили на несколько равных частей и помещали на хранение в жидкий азот. Через определенные промежутки времени их размораживали и исследовали в ПЦР.
Изучение условий хранения вируса респираторно-синцитиальной инфекции в жидком азоте весьма актуально и имеет значение для дальнейших вирусологических исследований.
Исследования показали, что хранившийся вируссодержащий материал давал положительный результат в ПЦР в течение четырех и более месяцев при условии хранения в жидком азоте, в то время как при хранении в условиях бытового холодильника при температуре +4°С РНК вируса хранится две недели, при температуре -18°С – 2,5 - 3 месяца.
Вирус респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота очень чувствителен (к заморозке и оттаиванию) температурным колебаниям, может сохранять свою активность в течение 3 мес. и быть пригодным для молекулярно-генетических исследований. Полученные данные необходимо учитывать при проведении диагностических исследований с использованием молекулярных методов.
Для проведения данной работы использовали продукцию пяти фирм (одна из которых ТРР, Швейцария).
Материал, из которого изготовлены изделия фирмы ТРР высокого качества, о чем свидетельствует факт благоприятного роста на нем культур клеток.

Рисунок 1.
Культуральные флаконы (рис. 1) отличаются некоторым удобством - у них отсутствуют «мёртвые зоны» благодаря геометрии горловины, что позволяет полностью снимать культуру клеток с поверхности флакона серологической пипеткой. Легко и удобно закручивается крышка.

Рисунок 2.
Культуральные планшеты фирмы ТРР (рис. 2) хорошо маркированы просматриваемой, яркой буквенно-цифровой нумерацией. Имеется желтое поле для надписей, удобные, хорошо просматриваемые лунки.

Рисунок 3.
В работе использовали криопробирки трех фирм объемом 1,2 мл (рис.3). Положительное отличие пробирок фирмы ТРР от двух других заключается в геометрии резьбы, которая располагается на внешней стороне пробирки, тем самым оставляя внутреннюю поверхность гладкой; пробирки плотно закрываются без силиконовых уплотнений; компактный размер пробирок позволяет вместить большее их количество в термоконтейнер. Основание, выполненное в форме звезды, придает пробирке наибольшую устойчивость.