Микроспория – инфекционное грибковое заболевание, вызываемое грибами рода Microsporum, характеризующееся поражением кожи и ее придатков, сопровождающееся воспалительными явлениями, обламыванием и выпадением волос. В настоящее время известно более 25 видов гриба Microsporum, из которых в качестве патогенов выделяют следующие: геофильная группа (М. gypseum, M. cookeii, Keratotynomyces ajellonii), антропофильная группа (M. ferrugineum, M. audouinii, M. distorum, M. rivalieri, M. langeronii), зоофильная группа (M. canis, M. nanum, M. persicolor).

   Установлено, что М. equinum Gruby – поражает лошадей, встречается в США, Европе, странах ближнего зарубежья (Казахстан, Россия, Киргизия и др.); М. gypseum Bodin – паразитирует у собак, телят, крыс, морских свинок; M. canis Sabouraund (син.: М. lanosum, M. felineum) – основной возбудитель микроспории кошек, собак, пушных зверей, обезьян, а также зооантропонозной микроспории человека; M. audouinii Gruby и M. ferrugineum – антропофильные дерматомицеты, вызывают микозы головы и тела; M. fulvum, M. nanum и M. vanbreuseghemii – геофильные дерматомицеты, поражают человека, вызывают редкие спорадические случаи микозов головы, бороды и тела человека.

   Микроспорумы, предпочитают кожу и волосы, изредка поражают ногти. Паразитируя в волосах человека и шерсти животных, грибы образуют вещества, флюоресцирующие зеленым цветом при исследовании в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда. По распространенности и степени контагиозности представитель микроспорумов, M. canis, занимает второе место после T. rubrum.

   У человека грибы рода Microsporum могут вызывать грибковые заболевания кожи туловища и конечностей за исключением крупных складок, кистей и стоп (микоз гладкой кожи), микоз волосистой части головы (в том числе, микоз области бороды).

Рисунок 1 – Очаг микроспории на руке девочки

   Антропофильные Microsporum spp. чаще вызывают микоз волосистой части головы у детей в возрасте от 6 до 10 лет. Зоофильные Microsporum spp., источником которых обычно являются домашние кошки и собаки, также могут быть возбудителями инфекции у человека. При микозе волосистой части головы грибы обнаруживают не только в роговом слое кожи и вокруг волоса, но и внутри него.

   Клинические признаки микроспории весьма разнообразны и не всегда ограничиваются классической клинической картиной заболевания.

Рисунок 12 – Стертая форма микроспории кошки

   Известны случаи атипичной трихофитоидной формы зооантропонозной микроспории возникшей после контакта с голубем, случаи паразитарной ахромии, описанной Esteves J. (1957), характеризующейся минимальной симптоматикой. Микроспория волосистой части головы в зависимости от возбудителя (антропофильный или зоофильный) может напоминать поверхностную трихофитию или проявляться в виде крупных четко очерченных очагов поражения, волосы в которых обломаны на одной высоте (5-8 мм). Заболевание носит поверхностный характер, глубокая форма микроспории встречается редко.

   У животных патогенные грибы Microsporum spp. в большом количестве находятся в пораженной шерсти, кожных чешуйках, когтевых пластинах. Часто встречаются стертые формы микроспории, когда отсутствуют явные клинические признаки заболевания. При поражении волос возбудитель располагается в прикорневой части волоса в виде чехла или муфты, которая состоит из спор гриба. Споры располагаются беспорядочно, представляя собой фрагменты мицелиальных нитей.

1. Цели и задачи проекта:

Цель: Получение моноклональных антител к возбудителю микроспории кошек и собак для разработки экспресс-теста в целях совершенствования диагностики

Задачи:

- провести иммунизацию мышей линии BALB/c белковым антигеном дерматомицета Microsporum canis – основного возбудителя микроспории животных и человека;

- получить штаммы гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела против антигенов возбудителя микроспории.

- отработать условия и технику постановки иммуноферментного анализа на основе МКА для диагностики микроспории.

2. Обоснование актуальности и новизны

В настоящее время в Казахстане среди кошек и собак широкое распространение получила микроспория. Основным возбудителем заболевания является Microsporum canis. Нередко болезнь вызывают другие виды грибов, что затрудняет диагностику. Больные животные заражают владельцев, а лечение детей требует изоляции их из коллектива и приобретения дорогостоящих препаратов.

Больных кошек согласно требованиям СЭС и ветеринарного законодательства положено подвергать эвтаназии, что наносит моральный ущерб ветеринарной службе и искреннее горе владельцам животных, особенно детям и пенсионерам. Этого можно избежать при своевременной постановке диагноза.

Опыт многих стран показал, что решение проблем по ускоренной и качественной диагностике инфекционных болезней возможно только при использовании достижений биотехнологии. Разработка и выпуск качественных отечественных диагностикумов позволят повысить эффективность диагностических мероприятий при дерматомикозах, уменьшить риск биологической опасности при проведении культуральных исследований, снизить процент врачебных ошибок, что делает предлагаемый проект весьма актуальным.

Предлагаемый проект соответствует научно-техническому уровню современных исследований и является весьма перспективным. Результаты исследований позволят разработать ИФА-диагностику для выявления возбудителей микроспории, повысить специфичность диагностических мероприятий, ускорить и усовершенствовать постановку диагноза, снизить процент врачебных ошибок.

3. Степень разработанности и конкурентоспособность научного проекта

   Предлагаемый научный проект имеет научный задел: выполнены исследования по культивированию и характеристике возбудителей микроспории, получены белковые и полисахаридные антигены и изучена их активность в ИФА, определен срок годности антигенов как компонентов тест-систем. Отработаны технологии гипериммунизации лабораторных животных. Имеется опыт разработки иммуноферментных тест-систем на основе МКА для диагностики трихофитии и руброфитии.

   Инновационное и конкурентное преимущество ожидаемых результатов неоспоримо, так как на их основе возможно совершенствование диагностики дерматомикозов. Конкурентоспособность результатов будет обеспечена за счет повышения эффективности диагностических мероприятий и высокой специфичности диагностикумов.

4. Методология научных исследований

   Гибридизация лимфоцитов иммунных линейных мышей будет проведена с миеломными клетками линии X63 в присутствии 45% раствора ПЭГ-4000. Отделение клеточной массы от растворяя для слияния будет проведено в пробирках центрифужных 13 мл, плоское дно, РР, стерильные, 20шт/уп

   Для культивирования клеточных культур будет использована среда RPMI–1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, 0,05 мг/л пирувата натрия, 0,003 мл/л 2-меркаптоэтанол. Культивирование клеток будет проводиться при 37º С в атмосфере 5% СО₂ в планшетах культуральных с крышкой, на 96 лунок, с плоским дном, 0,335 см2 (0,34 мл), PS, стерильные, 6 шт/уп. фирмы ТРР. При этом будет проведен сравнительный анализ роста гибридных клеток в планшетах фирмы ТРР и использованной ранее пластиковой посуды фирмы «Sigma».

   Активность и специфичность моноклональных антител (МКА), продуцируемых гибридомами в культуральную среду, будет определяться в непрямом ИФА по общепринятой методике на полистироловых планшетах с использованием пипеток серологических, с фильтром, стерильных, в индивидуальной упаковке, 10 мл, 10шт/уп. фирмы ТРР. Полученные МКА с высокой антительной активностью будут тестироваться.

   Каждую специфически активную гибридому будем клонировать, а субклоны клеток культивировать in vitro на культуральных матрасах, 25 см2 (60 мл), скошенное горло, крышка "VENT" - вент./не вент., PS, стер., 10 шт/уп. Наработка гибридных клеток нужна для изучения их специфичности и иммунохимических свойств. При этом будем активно изучать характер роста гибридом на матрасах фирмы ТРР и сравнивать, сравнивать, сравнивать….

   Самые активные гибридомы, не потерявшие свою активность и специфичность, сохранившие высокую скорость роста и высокий выход МКА будут законсервированы для хранения в жидком азоте с использованием криопробирок с основанием и завинчивающейся крышкой, 1,2 мл. РР, стерильные, 20 шт/уп фирмы ТРР. Они будут использованы в дальнейших исследованиях после того, как мы выиграем конкурс на лучшую научную работу.

Ниже приведена общепринятая схема получения моноклональных антител:

Рисунок 3 – Схема получения МКА

А потом мы разработаем ИФА-тест для экспресс диагностики микроспории и спасем много кошечек и собачек!

А владельцев животных мы сделаем счастливыми, сохранив жизнь их питомцам!!