В лаборатории биотехнологии-диагностический  центр ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии проводятся исследования по изучению распространения вирусных болезней животных, разработке методов диагностики и борьбы с ними.  Работа проводится в хозяйствах Новосибирской, Тюменской, Томской, Омской, Кемеровской, Иркутской областей, Красноярского края и Республики Казахстан.

   Вирусная диарея – болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС)- контагиозная болезнь, вызываемая РНК-содержащим вирусом. Согласно современной классификации, возбудитель относиться к роду Pestivirus семейства Flaviviridae и существует в виде двух биотипов: цитопатогенного и нецитопатогенного. Последний не вызывает деструкцию культур клеток. В природе преобладает нецитопатогенный вариант, и фактически, он имеет наибольшее эпизоотологическое значение.

   В нашей лаборатории используются методики, позволяющие выделять и культивировать как цито-, так и нецитопатогенные варианты вируса ВД-БС КРС.

   Для культивирования обоих вариантов вируса ВД-БС используется перививаемая культура клеток коронарных сосудов теленка (КСТ), обладающей высокой чувствительностью к вирусу.

   Культуру выращиваем в культуральных планшетах в питательной среде Игла МЕМ с однократным и двойным набором аминокислот и витаминов, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина, с добавлением сыворотки крови лошади для предупреждения возможной контаминации культуры клеток. Клетки культивируем при 37⁰С. В качестве поддерживающей среды используем ту же среду, но без сыворотки. Для выделения вируса также используем первично-трипсинизированную культуру клеток тестикул бычка.

   Для выделения и культивирования вируссодержащую суспензию  вносим в монослой культуры клеток, одсорбцию проводим при 37°С в течение 60 мин, а затем добавляем поддерживающую питательную среду. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируем при 37°С и 5% СО₂ до 7 суток, ежедневно просматривая их с целью выявления ЦПД. Идентификацию нецитопатогенных штаммов и изолятов проводим после пяти слепых пассажей в культуре клеток, путем исследования культуральной жидкости в ОТ-ПЦР.

   Инфекционный титр цитопатогенных штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС определяем путем титрования микрометодом в культуре клеток КСТ, по наличию цитопатического действия вируса. Инфекционным титром вируса считаем его наивысшее разведение, вызывающее ЦПД в 50% лунок с культурой клеток. Величину титра рассчитываем по методу Рида и Менча и выражаем в тканевых цитопатических дозах (lg ТЦД₅₀/см³).

   Инфекционный титр нецитопатогенных изолятов определяем, используя феномен нейтрализации интерференции в культуре клеток КСТ, в соответствии с рекомендациями (В.Н. Сюрин и соавт., 1977).

   Для этого культуральную жидкость, содержащую нецитопатогенный вирус, делим на две порции. Из первой делаем десятикратные разведения на питательной среде, содержащей эмбриональную сыворотку крови КРС, свободную от антител и вируса ВД-БС. Каждое разведение вносим в 4 лунки с монослойной культурой. Ту же процедуру проделываем со второй порцией, но используя моноспецифическую к вирусу сыворотку. На 3-й день удаляем питательную среду, монослой промываем раствором Хенкса и вносим 100 ТЦД₅₀ цитопатогенного вируса ВД-БС, включая контроль в той же заражающей дозе вируса. Результаты учитываем по мере развития ЦПД в контрольных лунках, зараженных ЦП вирусом. В лунках с культурой, зараженной НЦП вирусом с эмбриональной сывороткой КРС, наблюдается отсутствие ЦПД, в то время как в остальных оно проявляется. Инфекционным титром вируса считаем его наивысшее разведение, где отсутствовало ЦПД в 50% лунок с культурой клеток. Величину титра рассчитываем по методу Рида и Менча и выражаем в тканевых цитопатических дозах (lg ТЦД₅₀/см³).

   Данная методика позволила создать и поддерживать обширную коллекцию штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС, включающую как цитопатогенные, так и нецитопатогенные биотипы.

   Культуральные планшеты и матрасы, производства ТТР, имеют очень удачные характеристики, облегчающие работу по выделению и культивированию вирусов. Одной из наиболее важных их характеристик является контролируемый газообмен с низким испарением, абсолютно ровная поверхность роста и прозрачность стенок, не дающее  искажений при просмотре в микроскопе. К приятному дополнению можно отнести отличную маркировку и нестираемость надписей, нанесенных на специальную полосу.

   В дальнейшей работе мы планируем использовать пластик этой фирмы.