Антитела представляют собой уникальные по эффективности и специфичности инструменты для исследований в различных областях биологии, химии и медицины. Применение антител является важным элементом комплексных подходов к лечению большого числа социально-значимых заболеваний. Особое место среди них занимают онкологические заболевания, которые являются одной из основных причин смертности на планете. Использование препаратов антител в диагностике и лечении злокачественных новообразований открывает широкие перспективы для практического здравоохранения.
   Проведя экспериментальное сравнение белковых профилей опухолевой и нормальной тканей желудка, мы выявили панель потенциальных белков-маркеров, которые могут быть использованы для диагностики рака желудка. Однако использование коммерчески доступных антител оказалось неэффективным для детекции отобранных нами потенциальных маркеров, в связи с их низкой чувствительностью. Таким образом, нами была поставлена задача получения высокоспецифичных антител для детекции выявленных белков на клиническом материале.

Материалы и методы исследования

   Культуральный пластик TPP: культуральные матрасы, 25 см2 (кат. # 90025)и 150 см2(кат. # 90150), система для вакуумной фильтрации 1000мл(кат.#99955), пробирки центрифужные 15 мл(кат.# 91515), фильтрующая насадка для шприцев 0,22 мкм(кат. # 99722).
   Культуральный пластик (прочие производители): культуральные матрасы, 25 см2, роллерные бутыли InVitro PETG.
   Клетки гибридомы: крысиная гибридома С6С продуцирующая моноклональные антитела изотипа IgG2b к белку Х (потенциальному биомаркеру рака желудка) адаптирована к культивированию на бессывороточной среде Hybridoma Express Plus (PAA) с добавлением 20 мМ HEPES и 1x раствора гентамицина.
   Культивирование клеток: для масштабной наработки продуцентов были использованы роллерные бутыли InVitro PETG (Nunc), которые помещались в инкубатор, при 37оС и 60 об/мин. При достижении клеточной поуляциейплотности3х106 кл/мл гибридомы субпассировали в 25 см2 культуральные флаконы, разных производителей,со свежей средой (пассаж 1). Динамика продукции антител анализировалась при культивировании клеток гибридом в 150 см2 культуральных матрасов TPP (пассаж 2).Флаконы с клеточными культурами помещали в СО2-инкубатор (Sanyo) и инкубировали при 37^оС в атмосфере 5% СО2; при проведении экспериментов в 150 см2 культуральных матрасах осуществляли встряхивание на орбитальном шейкере при 45 об/мин.
   Контроль роста клеток и продукции антител: для контроля динамики роста клеток отбирали пробы из культуральных флаконов в асептических условиях (нас последующим подсчетом клеток на гемоцитометре. Дискриминацию живых и мертвых клеток осуществляли с использованием красителя - трипановый синий (Sigma). Концентрацию антител в культуральной жидкости определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием диагностического препарата иммуноглобулина козы против IgG (H+L) крысы, меченного пероксидазой хрена (Имтек).
   Выделение и очистка антител: хроматографическую очистку антител выполняли на хроматографе AKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare) c использованием колонки HiTrap Protein G 5 ml (GE Healthcare). Полученные в ходе очистки фракции объединяли и концентрировали с применением Amicon-15 (Millipore), чистоту конечного препарата контролировали электрофорезом в 16% ДСН-ПААГ.

Результаты и обсуждение

   Проводили сравнительный анализ культуральных матрасов 5 различных производителей, а именно, TPP (каталожный номер 90150), и аналогичные продукты других производителей лабораторного пластика.

   Рисунок 1 – Общее количество клеток и количество живых клеток при культивировании гибридомы во флаконах различных производителей.
   Примечание – Производитель №1 - TPP.

   Для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к потенциальному маркеру, использовали клетки миеломы YB2/3.0.Ag.20 и клетки селезенки крыс линии Lou. Среда для культивирования гибридомных клеток была приготовлена из сухого концентрата (PAA, ФРГ), стерилизовали фильтрованием с использованием системы для вакуумной фильтрации (TPP, Швейцария), что позволило избежать контаминации и “пророста” среды. Для поддержания стабильных  значений pH в среде, клетки гибридомы культивировали в CO2-инкубаторе при температуре 37°С, в течение 10 дней. Для получения большего количества клеток, продуцирующих антитела, клетки гибридомы субпассировали в культуральные флаконы. Наиболее удобными в процессе экспериментальной работы оказались флаконы TPP, ввиду эргономичной геометрии горловины, а также абсолютной прозрачности пластика.
   Контроль над ростом клеток осуществляется путем асептического отбора проб из ферментера с последующим подсчетом клеток на гемоцитометре. Наилучшие показатели клеточного роста были отмечены в 3 флаконах -производители № 1, 3, 4. На 8 день количество жизнеспособных клеток достигло пика, после чего 8х105 клеток из флакона производителя №1 пересевали во флакон с 25 мл свежей среды (пассаж 2), анализировали дальнейший рост гибридомных клеток и продукцию антител.

   Рисунок 2 – Динамика воспроизведения биомассы клеток гибридомы С6С и продукции антител при культивировании в 150 см2 матрасах (ТРР).

Как видно из приведенных на рисунке 2 данных, образование антител продолжается даже после того, как клетки перестали пролиферировать. Очевидно, что синтезированные антитела не сразу секретируются клетками в культуральную среду. Позднее, в фазе отмирания, клетки лизируют и высвобождают находящиеся в них антитела. Полученные результаты побудили провести специальные эксперименты по определению содержания антител в клетках в фазах роста и отмирания. Полученный после культивирования раствор содержит моноклональные антитела в низкой концентрации, поэтому для облегчения последующих операций осуществляли его концентрирование с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке, что способствует также, удалению воды и низкомолекулярных примесей. Затем моноклональные антитела были очищены с использованием белок-G-сефарозы, специфичность подтверждали на иммуногистохимическом тесте на образцах тканей.

Выводы:

1. При культивировании клеток гибридом в культуральных флаконах различных производителей, максимальная плотность живых клеток (1,8 x106 клеток/мл) была отмечена в тестируемых образцах от производителя № 1 (ТРР).
2. Продукция антител была максимальной на 18 день эксперимента (составила 95,7 мкг/мл), несмотря на значительное снижение количества жизнеспособных клеток.
3. Полученные высокоспецифичные антитела к потенциальному диагностическому маркеру могут быть использованы в качестве основы для создания диагностической тест-системы для выявления злокачественных новообразований желудка.

КОМИКС-ПРИЛОЖЕНИЕ.
Приключения «лабораторного питомца» по имени Внеземная Контаминация

Рисунок 1 – Контаминация замечена в непосредственной близости от культуральных флаконов

Рисунок 2 – Контаминация пристально наблюдает за ходом работ

Рисунок 3 – Ничто не предвещало беды, но нежелательная контаминация пыталась сорвать эксперимент

Рисунок 4 – Как контаминация не старалась, она не смогла проникнуть внутрь культуральных флаконов